双向凝胶电泳原理/实验步骤

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双向凝胶电泳,广义上理解就是将某一样品进行电泳后,为了达到不同的分离目的在它的直角方向在进行一次电泳。常用的就是等电聚焦电泳(载体两性电解质pH梯度或固相载体pH电泳)之后在进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品经过电荷和质量两次分离之后,可以知道样品的分子量等电点等信息,分离的结果不是带而是点。

以等电聚焦–聚丙烯酰胺凝胶电泳为例的实验操作
双向凝胶电泳

双向凝胶电泳实验步骤

(一)水化上样

  1. 从冰箱中取出IPG胶条,室温下下放置10min;
  2. 沿着水化槽的边缘从左向又加入样品(槽两端各1cm不加样品),中间样品液一定要连贯,不要产生水泡,不然会影响胶条中蛋白质的分布;
  3. 用镊子轻轻撕去IPG胶条的保护层(碱性端较脆弱,应该小心操作);
  4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品液上(不要将样品液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收,还会使胶条下面产生气泡,如果有气泡,来回移动胶条,直到赶走气泡)
  5. 放置40min,直到大部分的样品被胶条吸收,慢慢加入矿物油,防止胶条水化过程中液体蒸发
  6. 将等电聚焦仪放于-20℃,水化11-15小时。

(二)等电聚焦

  1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上,加去离子水5-8ul;
  2. 取出水化好的胶条,将矿物油沥干,胶面朝下,将其置于润湿好的滤纸片上去除表面的不容物;
  3. 将IPG胶条面朝下置于聚焦盘中,胶条的正极对应于聚焦盘的正极,确保胶条与电极精密接触;
  4. 在每根胶条上滴2-3ml的矿物油;
  5. 对好正负极,盖好盖子。设置等电聚焦程序;
  6. 聚焦结束的胶条,立即进行平衡,第二向SDS-PAGE电泳或者是保存于-20℃,电泳前10min时取出。

(三)SDS-PAGE电泳

  1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶;
  2. 配制胶条平衡缓冲液;
  3. 准备厚的滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上,将另一份厚滤纸用Millio水浸湿,汲取多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品,这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹;
  4. 将胶条转移至样品水化盘中,加入6ml(17cm IPG)平衡缓冲液I,在水平摇床上摇晃15min;
  5. 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ,第一次平衡技术后,滤纸上离去多余的液体,放在平衡缓冲液Ⅱ中,继续在水平摇床上缓慢摇晃15min;
  6. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体,将第二向凝胶放在桌面上,凝胶的顶部面对自己;
  7. 琼脂糖液体加热溶解,在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液;
  8. 第二次平衡结束,取出胶条,用滤纸吸去多余的平衡液,用镊子夹住胶条一端,使胶面完全浸入在电泳缓冲液中漂洗几次;
  9. 将胶条背面朝向玻璃板,轻轻放在长玻板上,加入琼脂糖封胶液;
  10. 注意不要在胶条下产生气泡,将胶条和聚丙烯酰胺凝胶面完全接触;放置几分钟,待琼脂糖凝固;
  11. 打开二向电泳制冷仪,调温度至15℃;
  12. 将凝胶电泳转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液,接通电源,一开始低电流,待样品完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,加大电流,溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳;进行染色观察。
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