SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤

概述

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理,是根据检体中蛋白质分子量大小的不同,使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中,SDS-PAGE更是必不可少的操作,其通常用于检测蛋白的表达情况(表达量,表达分布),以及分析目的蛋白的纯度等。
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SDS-PAGE作用机理

蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷,为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关,我们在上样前,通常会进行一些处理(上样

缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠

(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构; β-巯基乙醇是强还原剂,它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后,经过高温处理,其目的是将SDS 与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷;另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于监控整个电泳过程;另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极,下方为正极),在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶,使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。

电泳启动时,蛋白样品处于pH6。8 的上层,pH8。8 的分离胶层在下层,上槽为负极,下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续:启动时Cl¯解离度大,Pro¯解离度居中,甘 aaCOO¯解离度小,迁移顺序为(pH6。8)Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区,同时也出现高电势,高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移,—COO¯向 Pro¯迁移。如:一个 Cl¯领路,—COO¯推动,蛋白在中间,这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中,由于胶联度小,孔径大,Pro¯受阻小,因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层,起浓缩效应,使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时,此时Pro¯,Cl¯,甘 aa 离子在 pH8。8 的溶液中,Cl¯完全电离而很快到达正极,甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质,而到达正极,只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro¯在电泳过程中,受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化,但每一瞬间,其所带电荷数除以单位质量是不同的,所以带负电荷多者迁移快,反之则慢,这就现了电荷效应。由于胶孔径小,而且成为一个整体的筛状结构,它们对大分子阻力大,小分子阻力小,起着分子筛效应,也就是蛋白质在分离胶中,以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异,最终达到彼此分开。

PAGE 胶的聚合原理:甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合,形成胶,如下图:

SDS-PAGE聚合

注:催化剂:过硫酸铵(AP)在隔氧的状态下,最好现配现用,使用新鲜的。

加速催化剂:TEMED,四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围:

丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(KD)
15 10~ 43
12 12~ 60
10 20~ 80
7.5 36~ 94
5.0 57~212

试剂及主要器材

通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂:

1、主要试剂

  •  30%凝胶贮备液:丙烯酰胺(Acr)29.2g,亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g,加双蒸水至100mL。外包锡纸,4℃冰箱保存,30天内使用。
  • 分离胶缓冲液(1.5mol/L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8,定容100mL。4℃冰箱保存
  • 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L): Tris 6.06g,加水溶解,6mol/L HCl调8,并定容到100mL。4℃冰箱保存
  • 电极缓冲液(pH8.3):SDS lg,Tris 3g,Gly 14.4g,加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。
  • 10%SDS,室温保存
  • 质量浓度10%过硫酸铵(新鲜配制)
  • 上样缓冲液:5mol/L Tris-HCl pH6.8  1.25mL,甘油2mL,10%SDS 2mL,β-巯基乙醇1mL,0.1%溴酚蓝0.5mL,加蒸馏水定溶至10mL。
  • 考马斯亮蓝R-250染色液(1L):1g考马斯亮蓝R250,加入450甲醇,100ml冰醋酸
  • 脱色液(1L):100ml甲醇,100ml冰醋酸
  • 未知分子量的蛋白质样品(1mg/mL )

2、实验器材

  • 垂直板电泳槽
  • 电泳仪
  • 长滴管及微量加样器
  • 烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cm´l5cm)
  • 枪头(1ml、200ul、10ul)
  • 注射器等

SDS-PAGE所需溶液:

A液——30%丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g,加入去离子水定容至100mL,pH值不能超过7.0,过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L  Tris·HCl,pH8.8:18.17g(9.09g)Tirs碱,溶于60mL(30mL)去离子水中,加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8,定容至100mL(50mL)。

C液——1.5mol/L  Tris·HCl,pH6.8:12.1g(6.05g)Tirs碱,溶于60mL(30mL)去离子水中,加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8,定容至100mL(50mL)。

D液——10%SDS:10g (2g)SDS溶于去离子水中,定容至100mL(20mL),加热至68℃助溶。

E液——10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低温保存。

聚丙烯酰胺(Acrylamide)的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择TRIS-HCL系统。

TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行。

十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。

SDS-PAGE实验标准操作流程

1. 清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉  轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2. 灌胶与上样

  • 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。)
  • 配 12%分离胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用 3ml的吸管或10ml 枪吸取适量的胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。)

分离胶和浓缩胶的制备:按下表中溶液的顺序及比例,配置12%的分离胶和5。1%的浓缩胶。

试剂名称 12%的分离胶(8块,35ml) 5.1%的浓缩胶(8块,12ml)
30%凝胶贮备液/ml 14 2
分离胶缓液

(pH8.8)/ml

8.75
浓缩胶缓冲液(pH6.8)/ml 3
双蒸水/ml 12.25 6.9
10%过硫酸铵/ul 175 100
TEMED/ul 15 10

注:分离胶与浓缩胶的浓度计算公式:

A%*Va/V总 =C ,A%为30%凝胶贮备液,

例如,12%的分离胶:0。3*10/25=12%

  • 当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
  • 按前面方法配 5.1%的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
  • 用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
  • 测完蛋白含量后,计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中,加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。(上样总体积一般不超过 15μl,加样孔的最大限度可加 20μl 样品。)上样前要将样品于沸水中煮 5min 使蛋白变性。
  • 加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次,以免交叉污染。

3. 电泳

加样完毕,盖好上盖,连接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电压控制在100~200V,大约15~20min;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后,电压升到200V,电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1~2cm处即停止电泳,约0。5-1小时。如室温高,打开电泳槽循环水,降低电泳温度。

电泳。

4. 染色、脱色

电泳结束后,关掉电源,取出玻璃板,在长短两块玻璃板下角空隙内,用刀轻 轻撬动,即将胶面与一块玻璃板分开,然后轻轻将胶片托起,指示剂区带中心插入铜丝作为标志,放入大培养皿中染色,使用0。25%的考马斯亮蓝染液,染色2~4h,必要时可过夜。

弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几次,然后加入脱色液,进行扩散脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清晰为止。

5。 结果处理

  • 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离),测量指示染料迁移的距离。
  • 按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)

相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)

  • 标准曲线的制作:以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标,蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图,得到一条标准曲线。
  • 测定蛋白质样品的分子量:根据待测蛋白质样品的相对迁移率,从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。

SDS-PAGE电泳实验流程图
SDS-PAGE电泳实例图

注意事项

  • APS和TEMED是促凝的,根据温度加入的量是可以变动,一般不超过30%。
  •  玻璃板一定要洗干净,否则制胶是会有气泡。
  • 聚丙烯酰胺具有神经毒性,操作时注意安全,戴手套。(凝胶以后,聚丙烯酰胺毒性降低。)
  • 凝胶的时间要严格控制好,一般在20-30min。
  •  点样时,如果孔比较多,尽量点在中央。(点在边上时,跑出的带是斜的)
  • 点样前要排尽胶底部的气泡,防止干扰电泳。
  • 电泳结束后,取胶时,小心把玻璃板翘起(防止再次落下)。
  • 脱色时,尽量多次进行换水。
  • 上样量不宜太高,蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,,一般<15μl。
  • 做胶时,凝胶时间控制在25min。梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
  • 上样时,Marker最好标在中间,边上的孔尽量不要上样。
  • 制胶时,在加APS前尽量不要搅拌,加入APS后可以轻轻搅拌,不要产生气泡。
  • 分离胶缓冲液的pH一定要准确,尽量在20℃左右调掉8.8
  • 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝,防止夹坏玻璃板,避免缓冲液渗漏。
  • 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
  • 微量注射器(加样器)上样时, 注射器不可过低,以防刺破胶体;也不可过高, 样品下沉时易发生扩散,溢出加样孔。
  • 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。

注意:温度,时间,光照,APS和TEMED都会对凝胶产生影响

查看SDS-PAGE实验FAQ:SDS-PAGE常见问题(FAQ)

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