琼脂糖凝胶电泳原理/实验步骤/特点/相关FAQ

本文主要介绍了琼脂糖凝胶电泳的原理及实验操作步骤,及电泳后DNA的回收方法;琼脂糖凝胶的特点及电泳实验相关试剂的配置及琼脂糖凝胶电泳常见问题分析。
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琼脂糖凝胶电泳样品制备

大肠杆菌质粒DNA模板提取:

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基

2、37℃振荡培养过夜

3、取100ul菌体于2mlEp管中,4000rpm离心3min,弃上清

4、加100ul溶液A(1%葡萄糖50mM/L EDTA pH8。0,25mM/L Tris-HCl pH8。0)充分混合

5、加入200ul溶液 B(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min

6、加入150ul预冷溶液C(5 mol/L KAc,pH4。8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min

7、10000rpm离心20min,取上清

8、加入等体积的异戊醇,混匀后于60℃静置10min

9、再次10000rpm离心20min,弃上清

10、用500ul70%的乙醇洗涤,抽干所有液体

11、待沉淀干燥,溶于5ul的TE缓冲液中(通常可获得3-5ug的DNA)

真核细胞DNA模板提取:

真核细胞DNA的提取是进行功能和结构研究的重要一步,真核DNA提取要保证DNA的完整性(不断裂)。真核DNA可以从培养的细胞新鲜的组织中提取。通常都是采用蛋白酶消化后用酚抽提获得。不同来源的材料进行不同的预处理,但是后续提取DNA的方法是类似的,提取的原则就是,尽量减少对DNA的破坏或降解,保持其完整性。具体提取步骤如下:

(一)材料预处理:

培养细胞用缓冲液洗涤后离心(4000rpm/5min)去除上清,得到细胞沉淀物加入10倍体积的裂解缓冲液,55℃水浴1-2小时;

组织(组织要剪碎匀浆)加入1。5ml到离心管中,加入20%的SDS 25ul,蛋白酶K(2mg/ml)25ul,然后混匀,60℃水浴1-3小时;

(二)DNA的提取(适用于处理后的细胞或组织)

  1. 预处理的样品加入饱和酚,轻轻混匀几分钟后离心(5000rpm/10min),去上层水相;
  2. 加入等体积的饱和酚,混匀,再次离心,去上层水相;直至去上层水相变得澄清,不然可重复此操作;
  3. 加入十分之一的3M错酸钠(pH2.5)HE 2.5倍体积的无水乙醇,轻轻混匀;
  4. 出现絮状物后离心(5000rpm/10min),弃上清;用75%乙醇洗涤沉淀,再次离心,弃上清;
  5. 室温下晾干(待乙醇挥发),加入100ul TE溶解即可。

提取DNA的物品需要高压灭菌,以防止带入其他核酸污染;试剂同样高压灭菌;

PCR扩增

PCR扩增实验步骤详见:PCR标准操作流程

琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳,是以琼脂糖为介质,对不同大小的DNA或RNA实现分离的一种电泳方法。琼脂糖是一种多糖,具有亲水性,但是不带电荷。使得DNA在碱性条件下使其带负电荷(pH8.0的缓冲液),在电流作用下,以琼脂糖凝胶为介质,由负极向正极移动,根据不同的DNA分子片段的大小和形状不同,在电场中泳动的速率也不相同,同时在样品中加入染料(如EB或花青素类染料)能够和DNA分子间形成络合物,经过紫外照射,可以看到DNA的位置(比对marker可知分子量大小),从而达到分离、鉴定的目的。如图1为琼脂糖凝胶电泳原理。琼脂糖凝胶电泳原理

图1:琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳优点

  1. 琼脂糖凝胶是具有大量微小孔道的基质,其孔径尺寸取决于它的浓度。0.075琼脂糖的孔径为800nm,0.16的孔径为500nm,1%的琼脂糖孔径为150nm,这都是常用的琼脂糖凝胶的浓度,可以分离0.1-60kb左右的DNA,大孔性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备;
  2. 琼脂糖具有较高机械强度,允许在1%或更低的浓度下使用;且与别的生物只存在微弱的结合;
  3. 琼脂糖无毒,琼脂糖胶凝固过程不会发生自由基聚合,无需催化剂;
  4. 琼脂糖胶具有热可逆性,低熔点易于回收样品,可用于对温度敏感材料的制备;
  5. 易于保存,是高灵敏放射自显影的理想材料。

琼脂糖凝胶电泳步骤

琼脂糖凝胶电泳仪器

图2:琼脂糖凝胶电泳仪器

  1. 用蒸馏水将制胶工具洗干净,准备好制胶平板,用琼脂将模具边缘封闭,架好梳子;
  2. 根据要分离的样品(DNA)大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。准确的称取一定量的琼脂糖干粉,加入到合适体积的锥形瓶中,加入一定量的电泳缓冲液(30ml左右TAE);放入到微波炉内加热融化,冷却片刻(不烫手即可);
  3. 融化后的琼脂溶液摇晃混匀,倒入电泳槽中,等其凝固;
  4. 室温下凝固30-40min左右,小心的拔出梳子,取出凝固好的凝胶放入电泳槽内,准备上样;
  5. 在电泳槽中倒入电泳缓冲液(TAE);没过胶面1mm左右,去除胶孔内的气泡;
  6. 上样,5ulDNA样品加入1ul上样缓冲液(loading buffer)和1ul的染料,用抢混匀后加入到凝胶孔内;
  7. 上样结束,接通电源,红色正极,黑色负极,DNA样品有负极往正极运动,加样孔侧为负,,40-50v电压,电压30敏左右即可(<40min);
  8. 电压结束,关闭电源,凝胶成像仪上观察电压位置并比对marker判断大小。

琼脂糖凝胶配制浓度与DNA的最佳分离范围

琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA大小/kb 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3

琼脂糖凝胶电泳相关试剂配置

(一)50 x TAE buffer(pH8.5)
在1L烧杯中准确称取Tris 242g,EDTA(Na)37.2g,加入800ml的去离子水,充分搅拌溶解,加入57.1ml的乙酸,充分搅拌,调pH8.5后,定容至1L。每次使用加水稀释50倍即1xTAE buffer。
(二)10 x TBE buffer(pH8.3)
在1L烧杯中准确称取Tris 108g,EDTA 7.44g,硼酸55g,加入800ml的去离子水,充分搅拌,调pH8.3后,定容至1L。
(三)6 x loading buffer
在500ml烧杯中,准确称取EDTA 4.4g,二甲苯青FF250mg、溴酚蓝(Bromophenol Blue)250mg,加入200ml去离子水,加热至充分溶解;在加入180ml甘油,条pH为7.0,用去离子水定容至500ml,常温保存。

琼脂糖凝胶电泳结束DNA的回收

对一些电泳结束的DNA进行回收,用于亚克隆或者探针标记。常用的方法有低熔点琼脂糖法,压碎法。或使用目前较为方便的试剂盒回收。下面介绍冻融法回收DNA片段。

  1. 切胶(无核酸污染的干净刀片切):电泳结束后,切下对应片段大小的琼脂糖凝胶,置于1.5ml的离心管中;
  2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH7.6),振荡混匀,在-20℃放置10min;
  3. 低温离心(10000rpm/5min),将离心上层转移至新的离心管中;
  4. 在含胶的离心管中加入一半体积的水,振荡混匀,在-20℃放置10min;
  5. 低温离心(10000rpm/5min),合并上清液;
  6. 用等体积的酚和氯仿分别抽提一次,获得上清;加入十分之一体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀;在-20℃放置30min;
  7. 低温离心(13000rpm/10min),弃上清,75%乙醇洗沉淀2次,待乙醇挥发后加入水或者TE溶解即可。

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