大肠杆菌表达实验标准操作流程(SOP)

实验原理和目的

原理:将外源基因插入质粒或其他载体,再导入活的宿主细胞,使外源基因高效表达,获得所需的蛋白质。大肠杆菌蛋白表达原理及IPTG诱导原理详细内容请访问:原核表达IPTG诱导原理
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实验试剂

  • 质粒
  • 感受态细胞
  • TE:10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0
  • LB:试管4ml;固体平板
  • 抗性:A+(100mg/ml);   K+(50mg/ml);  CI
  • 保种甘油:C=80%   V=100ml
  • IPTG
  • 1 x PBS
  • 2 x Loading Buffer
  • DDH2O

实验仪器

  • 冰箱(4℃)
  • 超低温冰箱(-80℃)
  • 水浴锅(42℃)
  • 摇床(37℃;195r)
  • 培养箱(37℃)
  • 可见分光光度计(OD600;OD=0.6-0.8)
  • 离心机(6000r/min)
  • 煮样器(100℃;25min)

详细实验步骤

  1. 表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择
  • 拿到质粒,离心(3000r/min;2min)
  • 在质粒中加入TE【使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng,据此确定加入TE的量】,一般为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)
  • 将质粒与TE混匀,吸取2μL混液与感受态细胞混匀
  • 将感受态细胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 取出后立即放入水浴锅中(42℃),热激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
  • 放入摇床(37℃;  195r) 中,  30nim至60min; (最佳45min)
  • 取出离心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清悬浮沉淀,吸取50μL悬液涂平板,【先将对应抗性的平板放入培养箱(37℃)中预热20min】
  • 把平板放入培养箱(37℃),过夜(12h至16h)

2.  表达鉴定第二天的任务,注意Pcold表达载体的表达温度

  • 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”
  • 将试管放入摇床(37℃;195r) 中,【单抗性3h左右;双抗性4左右;刚开始用可见分光光度计测OD值;熟练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,刚刚看不见枪头即可)】,测OD值(0.6至0.8)
  • 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存
  • 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适,可根据日后表达摸索】
  • 视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX:15℃表达过夜;25℃表达6h;37℃表达3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃表达过夜;“2”“3”试管37℃表达3h至4h)。Pcold:【全部15℃表达过夜】

3. 表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度

  • 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中,【若OD值不一样,值小的可多取】离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀【沉淀少的,可再取菌液离心,尽量使沉淀量接近】
  • 在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀,离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀
  • 在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况下,加入量不变;当溶质多且粘稠时,应使加入量增大,为降低粘度也可减少上液量】
  • 放入煮样器(100℃) 25min
  • 取出后离心(6000r/min)  3min,  电泳检测。
  • 蛋白表达量不错,进行蛋白纯化;蛋白表达量低或者没表达,可参考原核表达FAQ相对应解决方案解决。

4。 蛋白纯化:见蛋白纯化专题

仅供科研

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