免疫印迹(Western Blot)的常见问题(FAQ)

返回Western blot实验原理及操作步骤

作为免疫印迹(Western Blot)的基本原理,实验步骤的补充,本文列举免疫印迹的常见问题(FAQ),以供参考。

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1. Western blot结果中的背景为什么较高?

可能的原因及建议

  1. 膜封闭不够——延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液。
  2. 一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。
  3. 一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
  4. 膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
  5. 检测时曝光时间过长——减少曝光时间。

2. Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议

  1. 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。
    查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。
  2. 目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
  3. 样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。
  4. 上样量过高,太敏感——适当减少上样量。
  5. 一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
  6. 一抗不纯——纯化抗体
  7. 一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

3. Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议

  1. 检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。
  2. 检测样本低表达目的蛋白——提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
  3. 转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。
  4. 抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
  5. 一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
  6. 二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
  7. 洗膜过度——洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

4. 其它现象:

  1. 膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
  2. 反白(条带显白色)——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
  3. 蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。

5. TBS与PBS的区别

PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱(不过PBS易污染)。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液则首选PBS。
Western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。

6. Western是否可以同时加两种或者多种一抗

通常情况下只加一种一抗。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。

7. PVDF与NC膜的区别

PVDF膜价格较贵,可重复使用,结合能力较强。

NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性较PVDF膜差,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。

8. Western一抗的选用

理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。

9. Western抗体和ELISA抗体的区别

一般来说用于western的抗体主要识别氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。

做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

10. “短路”现象的产生和处理

如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1。5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

11. Western Blot的染色

  1. 阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
  2. 胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。
  3. 生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。

12. 大分子量蛋白转移效率低的解决方法

可以在转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇能增加蛋白质和NC膜的结合能力,同时可以延长高分子量蛋白质转移时间;转移缓冲液加入终浓度0。1%SDS,也是为了增加转移效率;选用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0。2微米);使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

13. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理

DAB显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物,该产物难溶于醇和其他有机溶剂,DAB的氧化还能引起聚合作用,导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中,酶将奈酚磷酸(底物)水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐(显色原)结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。

14. 酶显色与荧光显色的优缺点

免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应并结合,结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时,会催化底物水解、氧化或还原,从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术,前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上,形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,称为非标记抗体酶技术。

免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,但免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。

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